O método de Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) tem sido cada vez mais utilizado em diversos segmentos. Na medicina diagnóstica é utilizado na pesquisa de patógenos nas áreas de microbiologia, virologia e parasitologia. Outra aplicação de grande importância é na área genética, em estudos de clonagem e no diagnóstico de doenças, mutações e problemas de origem genética. Até na medicina forense a técnica possui espaço relevante, possibilitando análise de elementos biológicos na cena do crime. Na área ambiental, ajuda na diferenciação e classificação de plantas e seres vivos. É muito utilizado também para pesquisas genealógicas. Estas são apenas algumas das diversas aplicações deste método que revolucionou o segmento diagnóstico nos últimos anos e que tende a ser cada vez mais utilizado na Medicina Veterinária.

Resumindo de forma simples e objetiva, a técnica tem como objetivo final identificar se um segmento específico de DNA ou RNA está presente na amostra analisada. Partindo do princípio que este segmento pesquisado já possui sua estrutura conhecida, a técnica possibilita que apenas o segmento pesquisado (sequência alvo) seja multiplicado de forma significativa até atingir níveis detectáveis.

Explicando em detalhes…

Cada cromossomo é composto por sequências variadas de nucleotídeos distribuídos ao longo de dois filamentos (DNA), que estão conectados em forma de espiral. Os nucleotídeos do DNA podem ser compostos por 4 bases nitrogenadas (Adenina, Citosina, Guanina e Timina) que se ligam em pares através de pontes de hidrogênio, para formar a estrutura do DNA, conhecida como dupla hélice. No caso do RNA, a Timina é substituída pela Uracila e é composto por apenas um filamento. Como regra, as bases se ligam de forma específica, como por exemplo a Adenina sempre se liga com a Timina (com exceção no RNA) e a Citosina com a Guanina. Isso faz com que as duas moléculas que formam o DNA sejam idênticas, porém com “direção” oposta em relação à sequência das bases. Essas sequências de nucleotídeos que formam cada molécula de DNA constitui a informação genética, e são responsáveis pela expressão dos genes através da síntese de todos os aminoácidos que formam as proteínas presentes no organismo.

Para que um aminoácido seja produzido, é necessário um RNA mensageiro, que tem a função de copiar um segmento específico de uma molécula de DNA (transcrição) e posteriormente converter em um aminoácido (tradução).
Já no caso da divisão celular, a estrutura em dupla hélice do DNA de cada cromossomo deve ser separada. A partir disso a enzima DNA polimerase sintetiza uma molécula complementar para cada filamento que foi separado, resultando assim em uma cópia perfeita do DNA. Isso faz com que uma célula parental se divida em duas “células-filha” com a mesma informação genética. Esse mecanismo é chamado de replicação. Na replicação viral, pode ocorrer uma situação diferenciada, pois alguns vírus possuem RNA como material genético. Nestes casos, a enzima responsável pela replicação é a transcriptase reversa, que vai sintetizar uma molécula de DNA a partir da molécula de RNA.

A técnica de PCR utiliza o mesmo princípio da replicação celular, porém feito “in vitro”, com objetivo de multiplicar uma sequência específica de DNA (amplificação), permitindo assim identificar se essa sequência (sequência alvo) está presente na amostra analisada. Para que isso ocorra, é necessária uma etapa inicial chamada desnaturação, que faz com que as moléculas de DNA se separem ao serem submetidas a uma temperatura mais elevada. Em uma segunda etapa chamada anelamento, ocorre a ligação do primer à sequência alvo do DNA. O primer é uma pequena sequência de nucleotídeos (oligonucleotídeo) que se liga de forma específica à sequência alvo, e é responsável por “sinalizar” o início da síntese do segmento complementar de DNA a partir do local onde está fixado. Na terceira etapa, chamada de extensão, é o momento onde o DNA complementar é sintetizado pela ação da DNA polimerase termoestável (Taq polimerase), que só consegue agir se o primer estiver fixado. Essas etapas ocorrem de forma cíclica, orientadas por variações de temperatura e resultando na amplificação exponencial da sequência alvo. Para cada patógeno pesquisado utiliza-se um primer específico, responsável por amplificar de forma significativa apenas a sequência alvo, caso esteja presente.

Quando se trata de RNA vírus, uma etapa adicional no início do processo é necessária, para que o RNA seja convertido em DNA. Isso ocorre graças à ação da enzima transcriptase reversa.

O PCR Real Time (também chamado de qPCR) possui uma grande vantagem que é a possibilidade de quantificar a amplificação do DNA na amostra. Isso só é possível pois são adicionados marcadores específicos fluorescentes (sondas) que emitem luminosidade a cada ciclo de amplificação. Isso possibilita acompanhamento em tempo real da quantidade de DNA produzido e consequentemente a mensuração da quantidade inicial da sequência alvo presente na amostra analisada. Essa informação pode ser importante ao analisar o quadro clínico do paciente, auxiliando no acompanhamento da gravidade e evolução do quadro infeccioso. Além disso, o PCR Real Time é uma técnica mais rápida, com maior sensibilidade e especificidade quando comparada ao PCR convencional.

Como a técnica pesquisa o material genético do patógeno, é de extrema importância que a amostra enviada seja representativa. Para isto, deve-se conhecer o ciclo de cada enfermidade para garantir qual a amostra e em que momento do ciclo o patógeno de interesse tem probabilidade de estar presente na amostra. Outro ponto fundamental é a conservação da amostra, de forma que o material genético não seja inviabilizado. O uso de medicamentos como antibióticos e antifúngicos também podem interferir no diagnóstico.

Algumas situações podem gerar resultados falso negativos: amostra não representativa (como comentado acima), uso de antibióticos e antifúngicos e conservação inadequada da amostra. Importante observar que essas situações não são problemas intrínsecos da técnica de PCR, e sim fatores que fazem com que o material genético do patógeno não esteja presente na amostra.
Resultados falso positivos não ocorrem, desde que o processo seja rigorosamente acompanhado com amostras controles e processamento livre de contaminantes. Importante ressaltar que no caso de utilização recente de vacinas vivas atenuadas, o resultado pode ser positivo, porém em decorrência da vacina e não de um processo infeccioso.

Realizamos a técnica mais moderna, o PCR Real Time (também chamado de qPCR). Utilizamos como marcador fluorescente as Sondas TaqMan ao invés de SYBR Green, o que garante maior especificidade à técnica. Entre em contato com a nossa equipe e conheça os diversos painéis disponíveis com resultados rápidos e controle de qualidade em todas as amostras analisadas. Estamos à disposição para tirar dúvidas e orientar qual a melhor amostra e momento do ciclo da enfermidade com maior representatividade